На самом деле, в высших организмах, включая человека, разрывы ДНК могут быть восстановлены несколькими сложными механизмами репарации [6-7]. Наиболее частый из этих механизмов называется негомологичным соединением концов (NHEJ). В результате повреждения последовательностей ДНК эта система репарации вставляет или удаляет небольшие фрагменты ДНК в месте разрыва для восстановления поврежденной последовательности. Однако этот механизм очень подвержен ошибкам, и случайные вставки и удаления небольших фрагментов ДНК могут привести к резким изменениям исходной последовательности ДНК [8].

Исследователи используют ошибки, возникающие во время репарации ДНК, для того чтобы отменить экспрессию определенного гена. Действительно, случайные мутации часто приводят к появлению нефункционирующего гена, а затем нефункционирующего белка. Отмена генов очень полезна для исследования биологических эффектов их удаления, изучения сигнального пути или создания моделей заболеваний для проверки новых терапевтических подходов. Тем не менее, случайность изменений, вносимых NHEJ, позволяет исследователям слабо контролировать редактирование генов. В частности, эта система не может быть использована для исправления гена, вызывающего заболевание, путем восстановления его функции или для придания новых преимуществ манипулируемым клеткам [9].

Чтобы преодолеть эти ограничения, ученые используют вторую, менее распространенную систему репарации, основанную на гомологичной рекомбинации. Гомологичная рекомбинация — это молекулярный процесс, обеспечивающий высокоточную репарацию, при которой генетическая информация обменивается между двумя похожими молекулами ДНК. Когда происходит разрыв в геномной ДНК, неповрежденная идентичная молекула ДНК используется клетками для замены поврежденной.

Используя этот принцип, исследователи могут внедрить новую последовательность в геном клетки-хозяина довольно простым способом:

1. Комплекс Cas9/gRNA вводится в клеточные ядра, чтобы разрезать определенную последовательность геномной ДНК;
2. Исследователи также вводят молекулу ДНК в качестве гомологичного шаблона, содержащего модификации, которые они хотят ввести;
3. Cas9-опосредованный разрыв восстанавливается путем гомологичной рекомбинации введенного шаблона ДНК; другими словами, клетки обманом заставляют восстановить свой собственный геном с выбранными модификациями [9-10].

В заключение, следует отметить, что CRISPR/Cas9 представляет собой интригующий пример того, как ученые изобрели инструмент редактирования генома, объединив небольшой прокариотический защитный механизм и эукариотические механизмы репарации ДНК. Это открыло дверь для предложения терапевтических стратегий нового поколения для лечения генетических заболеваний, рака и многих других. Однако, несмотря на захватывающий потенциал CRISPR/Cas9, исследователи столкнулись с рядом проблем в применении этой технологии.

В следующей статье этой серии мы рассмотрим основные технические недостатки инструментария CRISPR/Cas9, такие как внецелевые события, и узнаем, как ученые преодолели эти проблемы и усовершенствовали систему для применения человеком.