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Serie CRISPR/Cas9: un viaggio avvincente da un primitivo sistema di difesa batterica a una tecnologia avanzata di editing genetico umano
19/01/2022

Serie CRISPR/Cas9: un viaggio avvincente da un primitivo sistema di difesa batterica a una tecnologia avanzata di editing genetico umano

Gli effetti collaterali di CRISPR/Cas9 e le attuali strategie per mitigarli.

Riassunto:

  • Il sistema CRISPR/Cas9 spesso non solo taglia esclusivamente nel sito del genoma previsto, ma anche in altri punti indesiderati, chiamati target aspecifici (dall’inglese off-targets);
  • I target aspecifici sono principalmente dovuti ad omologie di sequenza tra sgRNA e sequenze di DNA genomico diverse da quella target, nonché al grado di purezza e stabilità del complesso sgRNA/Cas9 all’interno delle cellule;
  • I ricercatori hanno implementato numerose strategie per ridurre al minimo i target aspecifici e aumentare la sicurezza del sistema CRISPR/Cas9.

Il sistema CRISPR/Cas9 funziona nei batteri e negli archaea come un sistema immunitario adattivo basato sull’RNA in grado di dirigere la proteina Cas9 verso il DNA complementare di un virus invasore, tagliandolo e distruggendolo. Come abbiamo appreso negli articoli precedenti (CRISPR2), CRISPR/Cas9 è uno strumento di editing genetico di origine batterica che sfrutta i sistemi di riparazione del DNA delle cellule, fornendo un’opportunità per effettuare terapia genica negli esseri umani. Per abilitare la sua capacità di targeting genetico, il sistema CRISPR può essere replicato utilizzando i seguenti tre componenti minimi:

  1. la proteina Cas9 che taglia il DNA;
  2. un RNA CRISPR specifico per la sequenza bersaglio (crRNA);
  3. un RNA transattivante ausiliario (tracrRNA).

I duplex di crRNA e tracrRNA possono anche essere fusi per generare un RNA chimerico chiamato “single-guide RNA” (sgRNA) [1]. I primi 20 nucleotidi dello sgRNA sono complementari alla sequenza del DNA bersaglio, seguita da una sequenza chiamata Protospacer Adjacent Motif (PAM) [2]. Semplicemente modificando la sequenza di sgRNA, i ricercatori possono fare in modo che Cas9 raggiunga il gene di interesse e tagli esattamente nella sequenza di DNA bersaglio adiacente al PAM [3].

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Nonostante il sistema CRISPR/Cas9 abbia dimostrato di essere una tecnologia di modifica del genoma senza precedenti, ci sono ancora diverse preoccupazioni per le sue applicazioni terapeutiche e cliniche su larga scala.

CRISPR/Cas9 è un sistema estremamente potente, ma anche molto impreciso [4]. Lo sgRNA induce Cas9 a tagliare in siti diversi da quello previsto, provocando quindi le cosiddette mutazioni aspecifiche (off-targets) con frequenza molto elevata (>50%) [5-6]. Un taglio in un target aspecifico è un effetto collaterale della modifica del genoma mediata da Cas9, che provoca alterazioni del DNA che possono portare a esiti biologici avversi imprevedibili. Questo taglio aspecifico è la conseguenza di piccole differenze tra lo sgRNA e la sequenza di DNA bersaglio che la proteina Cas9 non riesce a notare, tagliando la sequenza sbagliata come se fosse quella effettivamente presa di mira.

Quando i 20 nucleotidi di sgRNA sono progettati dai ricercatori per essere complementari alla sequenza di DNA del gene di interesse, significa che sgRNA e sequenze di DNA mirate corrispondono perfettamente l’una all’altra. Tuttavia, altre sequenze di DNA nella cellula ospite possono essere parzialmente simili al motivo preso di mira da sgRNA/Cas9. Sequenze simili ma non identiche a quella di interesse sono riconosciute e tagliate da Cas9, e il numero di tagli aspecifici dipende fortemente da quante di queste sequenze omologhe esistono all’interno del genoma.

I tagli aspecifici potrebbero essere dipendenti dal tipo cellulare ma soprattutto dall’integrità delle vie di riparo del DNA di un particolare tipo cellulare [7]. Inoltre, è stato riscontrato che il grado di purezza della proteina Cas9 e dello sgRNA influisce sulla specificità dell’attività di taglio. È stato riportato che il tempo che Cas9 trascorre all’interno delle cellule è direttamente proporzionale all’aumento degli eventi di taglio aspecifici [8], quindi sarebbe vantaggioso che il complesso sgRNA/Cas9 tagliasse il DNA bersaglio immediatamente dopo l’iniezione nella cellula per degradarsi subito dopo.

Per poter portare la tecnologia CRISPR/Cas9 nel sistema sanitario, la necessità di ridurre efficacemente gli eventi di taglio aspecifici è diventata una priorità. Infatti, gli effetti aspecifici nell’editing genetico rappresentano un rischio non trascurabile per la sicurezza dei pazienti, poiché possono causare alterazioni del DNA che potrebbero evolvere in cancro o altri esiti indesiderati. Alla luce di queste considerazioni, sono stati proposti diversi approcci per ridurre al minimo gli effetti fuori bersaglio.

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Un primo approccio prevede di alterare la sequenza di sgRNA. In particolare, il troncamento del sgRNA o l’aggiunta di due nucleotidi specifici chiamati guanine alla fine di sgRNA sono in grado di aumentare la specificità verso il bersaglio, diminuendo le mutazioni indesiderate in siti aspecifici al di sotto dell’1%. Tuttavia, le modifiche della sequenza dei sgRNA per migliorare la specificità di Cas9 senza compromettere l’efficienza sul bersaglio non hanno fornito risultati affidabili [9]. Una seconda strategia promettente per minimizzare i tagli aspecifici è controllare la concentrazione e la formulazione del complesso sgRNA/Cas9, al fine di controllarne la stabilità ed il comportamento all’interno delle cellule [10]. Infine, altri approcci si concentrano sulla modifica della stessa Cas9. In particolare, per migliorare ulteriormente la specificità del taglio del DNA, sono state generate fusioni della Cas9 inattiva con il dominio nucleasico FokI. La Cas9 modificata è in grado di tagliare il DNA bersaglio con una specificità significativamente maggiore rispetto alla sua controparte wild type e di ridurre enormemente gli eventi di taglio aspecifici [11].

Negli ultimi anni sono emersi molti altri strumenti di nuova generazione per rendere il sistema CRISPR/Cas9 adatto alle applicazioni cliniche. I progressi della bioinformatica e dell’ingegneria genetica stanno fornendo strumenti per migliorare sgRNA e Cas9 in termini di efficacia e sicurezza [12].

Mentre i ricercatori stanno facendo il possibile per mitigare i tagli aspecifici, i medici potrebbero essere costretti a scegliere tra somministrare la terapia genica e incorrere nel rischio di mutazioni aspecifiche o rinunciare a questa terapia e perdere l’opportunità di curare il paziente. Attualmente, oltre 20 studi clinici sono stati approvati per l’uso della tecnologia CRISPR/Cas9 in pazienti [13]. Le implicazioni del rapporto costi/benefici dell’uso crescente di CRISPR/Cas9 stanno quindi portando alla richiesta di forti istituzioni normative e comitati di etica medica per prevenire qualsiasi abuso o trasgressione morale, come nel caso dei famosi bambini cinesi CRISPR che saranno il prossimo argomento di questa serie.

Referenze:

  1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  2. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
  3. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009. 
  4. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
  5. Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
  6. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
  7. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
  8. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024. 
  9. Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
  10. Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
  11. Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
  12. Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
  13. Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.
Raniero Chimienti
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