CRISPR/Cas9-Reihe: eine fesselnde Reise von einem primitiven bakteriellen Abwehrsystem zu einer fortschrittlichen menschlichen Gen-Editierung-Technologie
DNA-Reparaturmechanismen als Schlüssel zur Manipulation menschlicher Gene durch CRISPR/Cas9
Zusammenfassung:
- Im Jahr 2020 hat die CRISPR/Cas9-Technologie mehrere Durchbrüche erzielt, die den Bereich der Lebensmittel und der Medizin revolutionieren.
- CRISPR/Cas9 macht einen Bruch in der DNA und löst mehrere Zellreparaturmechanismen aus, die Forscher ausnutzen, um das Genom der Organismen zu manipulieren.
- Das als non-homologous end joining (NHEJ) bezeichnete DNA-Reparatursystem wird verwendet, um ein Gen zu inaktivieren, um seine Funktion zu untersuchen oder um Modelle von Krankheiten zu erstellen.
- Die auf homologer Rekombination basierende DNA-Reparatur hilft Forschern, ein defektes Gen zu flicken oder ein neues einzufügen, als mögliche Gentherapie für menschliche Krankheiten.
Trotz der Sorgen um die globale Pandemie wird 2020 höchstwahrscheinlich auch als das Jahr des Durchbruchs von CRISPR in Erinnerung bleiben. Neben dem Nobelpreis für Chemie, der an Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna verliehen wurde, ist die CRISPR/Cas9-Technologie aus anderen spannenden Gründen ins Rampenlicht gerückt.
Im April 2020 züchteten Wissenschaftler der Universität Kalifornien, Davis (UC Davis) mit Cosmo das erste gentechnisch veränderte CRISPR-Bullenkalb [1]. Im Dezember regelte das US-Landwirtschaftsministerium (USDA) nach der Entscheidung der US-Behörde für Lebens- und Arzneimittel (FDA) die Verwendung von CRISPR/Cas9 als neue Methode zur Gewinnung gentechnisch veränderter Nutzpflanzen [2-3]. Im letzten Sommer wurde CRISPR/Cas9 erfolgreich eingesetzt, um gesunde Blutzellen für die Behandlung einer an Sichelzellanämie erkrankten Frau zu erzeugen [4]. Darüber hinaus zeigten einige Monate zuvor Ergebnisse einer klinischen Studie an der Universität Pennsylvania (US), dass der Einsatz von menschlichen T-Lymphozyten, die mit CRISPR/Cas9 manipuliert wurden, für die Krebstherapie in Frage kommt [5].
In unserem früheren Artikel haben wir vorgestellt, wie die CRISPR/Cas9-Technologie aus dem adaptiven Immunsystem von Bakterien abgeleitet wurde und wie sie funktioniert. CRISPR/Cas9 ist ein Komplex, der aus einem Protein (Cas9) und einer Leit-RNA (gRNA) besteht, die eine bestimmte DNA-Sequenz erkennen und darin einen Bruch erzeugen kann. In diesem Artikel gehen wir darauf ein, warum die Fähigkeit, DNA präzise zu schneiden, für die Forscher entscheidend ist und wie damit die Revolution begann, die wir auf dem Gebiet der Gentechnik erleben.
DNA-Brüche sind ein natürliches Phänomen in vielen Organismen. Zum Beispiel können physiologische DNA-Brüche während der Zellteilung auftreten, um den DNA-Austausch zwischen den Chromosomenpaaren zu erleichtern. Darüber hinaus können äußere Reize, wie UV-Strahlung und chemische Stoffe, Schäden an der DNA von Zellen verursachen, die normalerweise aus einem oder mehreren Brüchen der Doppelhelix bestehen. Um zu überleben, ist es zwingend notwendig, dass Zellen DNA-Läsionen reparieren, wann immer sie auftreten. Analog dazu führt der Cas9-Schnitt zu einem gezielten DNA-Bruch an einer bestimmten Sequenz, die Wissenschaftler unter Ausnutzung der Reparaturmechanismen der Zelle editieren wollen.
In der Tat können in höheren Organismen, einschließlich des Menschen, DNA-Brüche durch mehrere hochentwickelte Reparaturmechanismen wiederhergestellt werden [6-7]. Der häufigste dieser Mechanismen wird als non-homologous end-joining (NHEJ) bezeichnet. Als Folge einer Beschädigung von DNA-Sequenzen fügt dieses Reparatursystem kleine DNA-Stücke an der Bruchstelle ein oder entfernt sie, um die beschädigte Sequenz zu rekonstruieren. Dieser Mechanismus ist jedoch sehr fehleranfällig und das zufällige Einfügen sowie das Entfernen von kleinen DNA-Stücken kann zu dramatischen Veränderungen der ursprünglichen DNA-Sequenz führen [8].
Die Forscher nutzen diese Fehler, die bei der DNA-Reparatur auftreten, um die Expression eines bestimmten Gens außer Kraft zu setzen. In der Tat führen zufällige Mutationen oft zu einem nicht funktionierenden Gen und dann zu einem nicht funktionierenden Protein. Die Ausschaltung von Genen ist sehr hilfreich, um die biologischen Auswirkungen ihrer Entfernung zu untersuchen, einen Signalweg zu studieren oder Krankheitsmodelle zu erstellen, um neue therapeutische Ansätze zu testen. Allerdings erlaubt die Zufälligkeit der eingeführten Veränderungen bei der Gen-Editierung nur eine geringe Kontrolle durch die Forscher. Insbesondere kann dieses System nicht verwendet werden, um ein krankheitsverursachendes Gen zu korrigieren, indem seine Funktion wiederhergestellt wird, oder um den manipulierten Zellen neue vorteilhafte Eigenschaften zu verleihen [9].
Um solche Einschränkungen zu überwinden, nutzen Wissenschaftler ein zweites, selteneres Reparatursystem, das auf homologer Rekombination basiert. Die homologe Rekombination ist ein molekularer Prozess, der eine Reparatur mit hoher Genauigkeit ermöglicht, bei der die genetische Information zwischen zwei ähnlichen DNA-Molekülen ausgetauscht wird. Wenn ein Bruch in der genomischen DNA auftritt, wird ein intaktes identisches DNA-Molekül von den Zellen verwendet, um die beschädigten zu ersetzen.
Mit diesem Prinzip sind Forscher in der Lage, auf recht einfache Weise eine neue Sequenz in das Genom einer Wirtszelle einzuführen:
- Der Cas9/gRNA-Komplex wird in den Zellkern eingeführt, um eine bestimmte Sequenz der genomischen DNA zu schneiden;
- Die Forscher führen auch ein DNA-Molekül als homologe Vorlage ein, das die gewünschten Modifikationen enthält;
- Der Cas9-vermittelte Bruch wird durch homologe Rekombination der eingeführten DNA-Vorlage repariert; mit anderen Worten, die Zellen werden dazu gebracht, ihr eigenes Genom mit den gewählten Modifikationen zu reparieren [9-10].
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CRISPR/Cas9 ein faszinierendes Beispiel dafür ist, wie Wissenschaftler ein Genom-Editierwerkzeug erfunden haben, indem sie einen kleinen prokaryotischen Abwehrmechanismus und die eukaryotischen DNA-Reparaturmechanismen kombiniert haben. Dies öffnete die Tür für neue therapeutische Strategien der nächsten Generation für die Behandlung von genetischen Krankheiten, Krebs und vielen anderen. Doch trotz des faszinierenden Potenzials von CRISPR/Cas9 standen die Forscher bei der Anwendung dieser Technologie vor einigen Herausforderungen.
Im nächsten Artikel dieser Serie werden wir uns mit den großen technischen Nachteilen des CRISPR/Cas9-Werkzeugkastens befassen, wie z. B. außerplanmäßigen Off-Target-Ereignisse, und wir werden entdecken, wie die Wissenschaftler diese Probleme überwunden und das System für die Anwendung beim Menschen verbessert haben.
Quellen:
- https://ucdavis.app.box.com/s/cpipr5wwnrdr69k7s46l81kbtmzycfg7/file/694452573988
- https://www.aphis.usda.gov/brs/pdf/aphis-2020-0079.pdf
- https://www.fda.gov/media/74614/download
- https://www.npr.org/sections/health-shots/2020/12/15/944184405/1st-patients-to-get-crispr-gene-editing-treatment-continue-to-thrive
- https://science.sciencemag.org/content/367/6481/eaba7365
- Liang F, Han M, Romanienko P.J., & Jasin M. Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences, 95(9), 5172-5177 (1998)
- Ranjha, L., Howard, S. M., and Cejka, P. (2018). Main steps in DNA double-strand break repair: an introduction to homologous recombination and related processes. Chromosoma 127, 187–214. doi: 10.1007/s00412-017-0658-1
- Bothmer, A. et al. Characterization of the interplay between DNA repair and CRISPR/Cas9-induced DNA lesions at an endogenous locus. Nat. Commun. 8, 13905 (2017).
- Sonoda E, Hochegger H, Saberi A, Taniguchi Y, Takeda S. Differential usage of non-homologous end-joining and homologous recombination in double strand break repair. DNA Repair (Amst) 2006; 5: 1021–1029.
- Horii, Takuro, and Izuho Hatada. “Challenges to increasing targeting efficiency in genome engineering.” The Journal of reproduction and development vol. 62,1 (2016): 7-9. doi:10.1262/jrd.2015-151