El Premio Nobel de Química de este año hizo que los ojos del mundo se dirigieran a las dos científicas que iniciaron una revolución en el campo de las ciencias de la vida y la terapia génica de precisión, ya que transformaron un mecanismo inmunológico bacteriano -llamado «CRISPR»- en una herramienta molecular capaz de editar de forma precisa, fácil y barata el genoma de una gran variedad de células eucariotas, incluidas las humanas.

Para rendir homenaje a su gran trabajo, así como a otros muchos científicos que han contribuido al desarrollo de dicha tecnología, Facts&Reasons dedicará una miniserie al tema CRISPR-Cas.

Según se supo por los titulares de los principales periódicos y revistas de todo el mundo, el premio recayó conjuntamente en la Prof. Dra. Emmanuelle Charpentier, de la Unidad Max Planck para la Ciencia de los Patógenos, y en la Prof. Dra. Jennifer Doudna, de la Universidad de California, Berkeley, «por el desarrollo de un método para la edición del genoma». Definieron los detalles de sus hallazgos en un artículo publicado en el número de finales de junio de 2012 de la revista Science [1], pero antes de profundizar en él, debemos dar un pequeño paso atrás y entender qué es CRISPR y qué etapas precedieron a uno de los descubrimientos más importantes del siglo XXI.

Han pasado dos décadas desde que un microbiólogo, Francis Mojica, descubrió en la Universidad de Alicante (España) un sistema de defensa molecular desarrollado por los microbios tras miles de años de evolución [2-3]. Llamó a este sistema de defensa CRISPR, por sus siglas en inglés Clustered Regularly Interspaced Palindromic Repeat [4]. Este palabro hace referencia a la organización única de secuencias de ADN específicas dentro del genoma de varios microorganismos, que se desarrollaron de forma natural para montar unas tijeras moleculares para neutralizar activamente las infecciones víricas [5-6]. Una de las proteínas más conocidas del sistema CRISPR, que participa en el corte de las secuencias víricas, fue identificada posteriormente y denominada «proteína 9 asociada a CRISPR» o, más sencillamente, «Cas9» [7-8].

La inmunidad mediada por el complejo CRISPR se produce tras el ensamblaje entre la proteína Cas9 y el ARN CRISPR (ARNcr), una secuencia corta de ARN que puede emparejar secuencias complementarias del virus invasor u otros ácidos nucleicos exógenos [9]. El ARNcr actúa como una especie de explorador que conduce a Cas9 de forma precisa hacia el ADN extraño que es cortado en un lugar específico por él (la tijera molecular de este sistema). El lugar donde se produce el corte se encuentra justo al lado del comúnmente llamado motivo adyacente al protospacer (PAM), también conocido como la secuencia objetivo que Cas9 utiliza como referencia para dirigir el corte con precisión quirúrgica [1, 10-11]. Sin embargo, para cumplir con su papel de guía, el ARNcr necesita madurar a través de una interacción estable, en presencia de Cas9, con un ARNcr trans-activador (ARNcr) [12]. Sólo entendiendo la importancia del tracrRNA ha sido posible encontrar la clave para explotar el sistema CRISPR.

En su artículo de 2012, Charpentier y Doudna demostraron que la proteína Cas9 en complejo con un sólo ARNcr era incapaz de dirigir el corte de la secuencia objetivo. En cambio, añadiendo un tracrRNA al sistema y permitiendo el emparejamiento entre dichas moléculas trans-activadoras y el crRNA maduro, las dos científicas obtuvieron un corte perfecto de la secuencia de ADN diana in vitro. A partir de esta evidencia, su investigación prosiguió con la caracterización de los mecanismos moleculares implicados en el corte del ADN mediado por Cas9 hasta que comprendieron que podría ser posible sustituir el par tracrRNA:crRNA por un único ARN quimérico, preservando la capacidad de Cas9 de reconocer la diana.

Para comprobar la eficacia del sistema y establecer si el diseño de este ARN quimérico podría ser lo suficientemente robusto y universalmente aplicable, Charpentier y Doudna realizaron un sencillo y elegante experimento in vitro. Diseñaron cinco ARN quiméricos diferentes para que se dirigieran a la secuencia de ADN de una proteína verde fluorescente (lGFP por sus siglas en inglés) y, en los cinco casos, observaron que la proteína Cas9 guiada por estos ARN quiméricos cortaba con eficacia y precisión la secuencia de la GFP. Esto parecía un descubrimiento asombroso, ya que proponían un nuevo enfoque para cortar cualquier secuencia de ADN de interés siguiendo una única proteína Cas9 programada por un ARN guía.

Pero, ¿por qué es tan importante cortar el ADN y cómo se convirtió CRISPR/Cas9 en la «estrella» indiscutible entre las tecnologías de ingeniería genética actuales?

Los científicos han editando genes desde hace bastante tiempo antes de la aparición de la tecnología CRISPR.  Podemos imaginar el trabajo de un ingeniero genético como un fino proceso de cortar y remendar, donde el objetivo final podría ser, por ejemplo, la eliminación de un gen defectuoso (cortando) y la introducción del homólogo que funciona (remendando). Este escenario es la base de la terapia génica, en la que se coloca una nueva secuencia de ADN dentro del genoma de interés para sustituir o combinar con las nativas. La caja de herramientas de edición se estableció entre 1994 y 2010 en un esfuerzo conjunto entre la academia y la industria, utilizando tecnologías basadas en meganucleasas [13] y nucleasas con dedo de zinc (ZFN, del inglés zinc-finger nucleases) [14-15]. En 2010-2012, la caja de herramientas se enriqueció rápidamente con una tercera clase de nucleasas (proteínas de corte del ADN), denominadas nucleasa efectoras de tipo activador de la transcripción (también conocidas como TALEN) [16-17]. Tanto las ZFN como las TALEN son proteínas modulares que interactúan con el surco mayor de la estructura de doble hélice del ADN para reconocer pares de bases específicos. Sin embargo, a pesar de las ventajas relativas del uso de estas proteínas de corte de ADN previamente establecidas, el sistema basado en ZFN, en comparación con la tecnología emergente Cas9, era más difícil, requería más tiempo y era particularmente tóxico [18], así como el sistema TALEN parecía ser difícil de introducir en las células, debido a su gran tamaño, y era menos escalable para las estrategias de objetivos múltiples, ya que sólamente es capaz de reconocer una secuencia a la vez [18-19].

Gracias a los trabajos de Charpentier y Doudna, la tecnología basada en CRISPR/Cas9 creció exponencialmente a lo largo de los años, revelando pronto ser tan barata, rápida y excepcionalmente versátil como aconsejaban. Anticipándose a lo que Feng Zhang, del Instituto Broad, demostró seis meses más tarde [20] sobre la capacidad de CRISPR para trabajar en células de mamíferos, iniciaron una verdadera transformación científica y, al mismo tiempo, entraron en una feroz batalla de patentes sobre quién merece los derechos de propiedad intelectual de tal descubrimiento [21], que la asignación del Premio Nobel de 2020 sólo ha amainado ligeramente.