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Serie CRISPR/Cas9: un apasionante viaje desde un primitivo sistema de defensa bacteriano hasta una avanzada tecnología de edición genética humana
19/01/2022

Serie CRISPR/Cas9: un apasionante viaje desde un primitivo sistema de defensa bacteriano hasta una avanzada tecnología de edición genética humana

Los efectos secundarios de CRISPR / Cas9 y las estrategias actuales para mitigarlos

Resumen:

  • El sistema CRISPR/Cas9 a menudo no sólo corta en el sitio deseado del genoma, sino también en otros lugares no previstos, denominados off-targets;
  • Los eventos off-target se deben principalmente a la homología de secuencia entre el sgRNA y otras secuencias de ADN distintas de la diana deseada, así como al grado de pureza y estabilidad del complejo sgRNA/Cas9 dentro de las células; 
  • Los investigadores han implementado numerosas estrategias para minimizar estos off-targets fuera de la diana y aumentar la seguridad del sistema CRISPR/Cas9.

El sistema CRISPR/Cas9 funciona en bacterias y arqueas como un sistema inmunitario adaptativo basado en el ARN. Es capaz de dirigir la proteína Cas9 al ADN complementario de un virus invasor, y así cortarlo y destruirlo. Como hemos aprendido en los artículos anteriores, CRISPR/Cas9 es una herramienta de edición de genes derivada de bacterias que explota los sistemas de reparación del ADN de las células, lo que proporciona una oportunidad para hacer terapia génica en humanos. Para hacer posible su capacidad de reconocimiento de genes determinados, el sistema CRISPR puede reproducirse utilizando los siguientes tres componentes mínimos:

  1. la proteína Cas9 que corta el ADN;
  2. un ARN CRISPR de secuencia específica (ARNcr);
  3. un ARN trans activador auxiliar (tracrRNA).

Los dúplex crRNA y tracrRNA también pueden fusionarse para generar un ARN quimérico de guía (sgRNA) [1]. Los primeros 20 nucleótidos del sgRNA son complementarios a la secuencia de ADN objetivo, seguidos de una secuencia llamada motivo adyacente de protoespaciador (PAM, por sus siglas en inglés) [2]. Simplemente cambiando la secuencia del sgRNA, los investigadores pueden hacer que Cas9 alcance el gen de interés y corte exactamente en la secuencia de ADN diana adyacente al PAM [3].

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A pesar de que el sistema CRISPR/Cas9 ha demostrado ser una tecnología de edición del genoma sin parangón, todavía existen preocupaciones diversas cuando se trata de sus aplicaciones terapéuticas y clínicas a gran escala.

CRISPR/Cas9 es un sistema extremadamente potente, pero también muy impreciso [4]. El sgRNA induce a Cas9 a cortar en otros sitios que no son el objetivo previsto, causando entonces las llamadas mutaciones «off-targets» con una frecuencia muy alta (>50%) [5-6]. Un evento «off-target» es un efecto secundario de la edición del genoma mediada por Cas9, que da lugar a alteraciones del ADN que pueden conducir a resultados biológicos adversos impredecibles. Esta actividad de corte fuera del objetivo es consecuencia de pequeñas diferencias (o desajustes) entre el sgRNA y la secuencia de ADN objetivo. La proteína Cas9 no se percata de ellas, cortando la secuencia errónea como si fuera la verdadera diana.

Cuando los 20 nucleótidos del sgRNA son diseñados por los investigadores para que sean complementarios a la secuencia de ADN del gen de interés, significa que las secuencias del sgRNA y del ADN objetivo coinciden perfectamente entre sí. Sin embargo, otras secuencias de ADN en la célula huésped pueden ser parcialmente similares a la diana a la que se dirige el sgRNA/Cas9. Las secuencias similares pero no idénticas a la de interés también son reconocidas y cortadas por Cas9, y el número de sitios off-target depende en gran medida de cuántas de estas secuencias homólogas existen en el genoma.

Los efectos off-target podrían ser específicos de cada tipo de célula y depender en gran medida de la integridad de las vías de reparación del ADN de un tipo de célula concreto [7]. Además, se ha descubierto que el grado de pureza de la proteína Cas9 y del sgRNA también afectan a la especificidad del corte en cuestión. Se ha demostrado que el tiempo que Cas9 pasa dentro de las células es directamente proporcional al aumento de los off-targets [8], por lo que sería ventajoso que el complejo sgRNA/Cas9 cortara el ADN diana casi inmediatamente después de su entrada y después se degradara rápidamente en las células.

Para poder introducir la tecnología CRISPR/Cas9 en el sistema sanitario, es prioritario reducir eficazmente los eventos off-target. De hecho, los efectos off-target en la edición de genes representan un riesgo para nada despreciable para la seguridad de los pacientes, ya que pueden causar cambios en el ADN que podrían evolucionar en cáncer u otros resultados no deseados. A la luz de estas consideraciones, se han propuesto varios enfoques para minimizar los efectos off-target.

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Un primer enfoque se basa en la alteración de la secuencia del sgRNA. En concreto, el truncamiento del sgRNA o la adición de dos nucleótidos específicos llamados guaninas al final del sgRNA mejora la especificidad de la diana, disminuyendo las mutaciones no deseadas en algunos sitios off-target por debajo del 1%. Sin embargo, las modificaciones de la secuencia del sgRNA para mejorar la especificidad de Cas9 sin que la eficacia sea comprometida no han proporcionado resultados fiables [9]. Una segunda estrategia prometedora para minimizar los efectos off-target es controlar la concentración y la formulación del complejo sgRNA/Cas9, para controlar con precisión su estabilidad y comportamiento dentro de las células [10]. Otros enfoques se centran en la modificación de la propia proteína Cas9. En particular, para mejorar la especificidad de corte del ADN, se han generado fusiones de Cas9 inactiva con el dominio de la nucleasa FokI. La Cas9 modificada es capaz de editar el ADN diana con una especificidad significativamente mayor que su homóloga sin modificar o wild-type, y por lo tanto los eventos off-target se reducen considerablemente [11].

En los últimos años han surgido muchas otras herramientas de nueva generación para hacer que el sistema CRISPR/Cas9 sea adecuado para aplicaciones clínicas. Los avances en bioinformática e ingeniería genética están proporcionando herramientas para mejorar el sgRNA y el Cas9 en términos de eficacia y seguridad [12].

Mientras los investigadores se apresuran a mitigar los efectos off-target, los clínicos pueden verse obligados a elegir entre administrar la terapia génica e incurrir en el riesgo de que se produzcan estos eventos off-target o por el contrario, renunciar a esta terapia y perder la oportunidad de tratar al paciente. Actualmente, se han aprobado más de 20 ensayos clínicos para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 en pacientes [13]. Las implicaciones de la relación coste/beneficio del creciente uso de CRISPR/Cas9 están conduciendo a la demanda de instituciones reguladoras fuertes y comités de ética médica para prevenir cualquier abuso o transgresión moral, como en el caso de los famosos bebés CRISPR chinos, que será el siguiente tema de esta serie.

Bibliografía:

  1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  2. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
  3. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009. 
  4. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
  5. Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
  6. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
  7. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
  8. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024. 
  9. Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
  10. Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
  11. Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
  12. Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
  13. Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.
Raniero Chimienti
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