Série CRISPR/Cas9 : un voyage fascinant d’un système de défense bactérien primitif à une technologie avancée d’édition de gènes humains
Les effets secondaires de CRISPR/Cas9 et les stratégies actuelles pour les atténuer
Résumé :
- Le système CRISPR/Cas9 coupe souvent non seulement au site prévu du génome, mais également à d’autres endroits indésirables, appelés hors cibles;
- Les événements hors cible sont principalement dus à l’homologie de séquence entre le sgARN et l’ADN génomique autre que celui ciblé, ainsi qu’au degré de pureté et de stabilité du complexe guARN/Cas9 à l’intérieur des cellules;
- Les chercheurs ont mis en place de nombreuses stratégies pour minimiser les effets hors cible et augmenter la sécurité du système CRISPR/Cas9.
Le système CRISPR/Cas9 fonctionne dans les bactéries et les archées comme un système immunitaire adaptatif basé sur l’ARN. Il est capable de diriger la protéine Cas9 vers l’ADN complémentaire d’un virus envahisseur, et ainsi de le couper et de le détruire. Comme nous l’avons appris dans les précédents articles, CRISPR/Cas9 est un outil de modification génétique d’origine bactérienne qui exploite les systèmes de réparation de l’ADN des cellules, offrant une opportunité de faire de la thérapie génique chez l’homme. Pour activer sa capacité de ciblage génétique, le système CRISPR peut être répliqué à l’aide des trois composants minimaux suivants:
- la protéine Cas9 coupant l’ADN;
- une séquence ARN-CRISPR (ARNcr) spécifique;
- un ARN auxiliaire trans-activateur (tracrARN).
Les duplex de ARNcr et de tracrARN peuvent également être fusionnés pour générer un ARN chimérique à guide unique (guARN) [1]. Les 20 premiers nucléotides du guARN sont complémentaires de la séquence d’ADN cible, suivis d’une séquence appelée motif adjacent éspaceur (MAE) [2]. En modifiant simplement la séquence de guARN, les chercheurs peuvent faire en sorte que Cas9 atteigne le gène d’intérêt et coupe exactement dans la séquence d’ADN cible adjacente au MAE [3].
Bien que le système CRISPR/Cas9 se soit avéré être une technologie d’édition du génome sans précédent, ses applications thérapeutiques et cliniques à grande échelle suscitent encore plusieurs inquiétudes.
CRISPR/Cas9 est un système extrêmement puissant, mais aussi très imprécis [4]. Le guARN induit des erreurs de ciblage de Cas9, coupant ainsi a des endroits non désirés, provoquant alors des mutations dites « hors cible » avec une fréquence très élevée (> 50 %) [5-6]. Un événement hors cible est un effet secondaire de l’édition du génome médiée par Cas9, entraînant des altérations de l’ADN pouvant entraîner des résultats biologiques indésirables et imprévisibles. Cette activité de clivage hors cible est la conséquence de petites différences ou mésappariements (de l’anglais mismatch repair) entre le guARN et la séquence d’ADN cible. La protéine Cas9 ne les remarque pas, coupant la mauvaise séquence comme si c’était celle qui était réellement ciblée.
Lorsque les 20 nucléotides du guARN sont conçus par les chercheurs pour être complémentaires de la séquence d’ADN du gène d’intérêt, cela signifie que le guARN et la séquence d’ADN ciblée correspondent parfaitement l’une à l’autre. Néanmoins, d’autres séquences d’ADN dans la cellule hôte peuvent être partiellement similaires au motif ciblé par guARN/Cas9. Des séquences similaires mais non identiques à celle qui nous intéresse sont également reconnues et clivées par Cas9, et le nombre de sites hors cible dépend fortement du nombre existent de séquences homologues dans le génome.
Les effets hors cible peuvent être spécifiques au type de cellule et fortement dépendants de l’intégrité des voies de réparation de l’ADN dans un type cellulaire particulier [7]. De plus, le degré de pureté de la protéine Cas9 et du guARN s’est avéré affecter la spécificité de l’activité de clivage. Il a été rapporté que le temps que Cas9 passe à l’intérieur des cellules est directement proportionnel à l’augmentation des événements hors cible [8], il serait donc avantageux que le complexe guARN/Cas9 clive l’ADN cible presque immédiatement après l’incorporation dans les cellules et soit dégradé tout aussi rapidement .
Pour pouvoir intégrer la technologie CRISPR/Cas9 dans le système de santé, la nécessité de réduire efficacement les événements hors cible est devenue une priorité. En fait, les effets hors cible de l’édition de gènes représentent un risque non négligeable pour la sécurité des patients, car ils peuvent provoquer des modifications de l’ADN susceptibles d’évoluer vers un cancer ou d’autres résultats indésirables. À la lumière de ces considérations, plusieurs approches ont été proposées pour minimiser les effets hors cible.
Une première approche est basée sur la modification de la séquence du guARN. Précisément, la troncature de guARN ou l’ajout de deux nucléotides spécifiques appelés guanines à la fin de guARN améliore la spécificité de cible, diminu les mutations indésirables à certains sites hors cible en dessous de 1%. Cependant, les modifications de la séquence du guARN pour améliorer la spécificité de Cas9 sans compromettre l’efficacité sur la cible n’ont pas fourni de résultats fiables [9]. Une deuxième stratégie prometteuse pour minimiser les effets hors cible est de contrôler la concentration et la formulation du complexe guARN/Cas9, afin de contrôler finement sa stabilité et son comportement à l’intérieur des cellules [10]. D’autres approches se concentrent sur la modification de Cas9 lui-même. En particulier, pour améliorer la spécificité du clivage de l’ADN, des fusions de Cas9 inactif avec le domaine de la nucléase FokI ont été générées.Une fois modifié, Cas9 est capable d’éditer l’ADN cible avec une spécificité nettement plus élevée que son homologue de type sauvage et de réduire significativement la fréquence des événements hors cible [11].
De nombreux autres outils de nouvelle génération sont apparus ces dernières années pour rendre le système CRISPR/Cas9 adapté aux applications cliniques. Les progrès de la bioinformatique et du génie génétique fournissent des outils pour améliorer le guARN/Cas9 en termes d’efficacité et d’innofensivité pour le patient [12].
Alors que les chercheurs se précipitent pour atténuer les effets hors cible, les cliniciens peuvent être contraints de choisir entre administrer la thérapie génique et encourir le risque de mutations hors cible ou abandonner cette thérapie et rater l’occasion de traiter le patient. Actuellement, plus de 20 essais cliniques ont été approuvés pour l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9 chez les patients [13]. Les implications du rapport coût/bénéfice de l’utilisation croissante de CRISPR/Cas9 demande une mise en place d’institutions de réglementation et de comités d’éthique solides pour prévenir tout abus ou transgression morale, comme dans le cas des (très)célèbres CRISPR bébés chinois qui sera le prochain sujet de cette série.
Références:
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