Il Premio Nobel per la Chimica di quest’anno ha rivolto gli occhi del mondo verso le due scienziate che hanno dato inizio ad una rivoluzione nel campo delle scienze della vita e della terapia genica di precisione, poiché hanno trasformato un meccanismo immunitario batterico – chiamato “CRISPR” – in uno strumento molecolare in grado di modificare in modo preciso, semplice ed economico il genoma di un’ampia varietà di cellule eucariotiche, comprese quelle umane.

Per onorare il loro grande lavoro, così come molti altri scienziati che hanno contribuito allo sviluppo di tale tecnologia, Facts & Reasons dedicherà una mini-serie all’argomento CRISPR-Cas.

Come appreso dai titoli dei principali giornali e riviste di tutto il mondo, il premio è andato congiuntamente alla Prof. Dr. Emmanuelle Charpentier della Max Planck Unit for the Science of Pathogens, e alla Prof. Dr. Jennifer Doudna dell’Università della California, Berkeley, ” per lo sviluppo di un metodo per l’editing del genoma. ” Hanno definito i dettagli delle loro scoperte in un articolo pubblicato nel numero di fine giugno 2012 di Science [1], ma prima di approfondirlo, dobbiamo fare un piccolo passo indietro e capire cos’è CRISPR e quali fasi hanno preceduto uno dei più importanti scoperte del 21 ° secolo.

Sono passati due decenni da quando un sistema di difesa molecolare sviluppato dai microbi – dopo migliaia di anni di evoluzione – è stato scoperto da un microbiologo, Francis Mojica, presso l’Università di Alicante in Spagna [2-3]. Ha chiamato questo sistema di difesa CRISPR, che sta per Clustered Regularly Interpaced Palindromic Repeat [4]. Questo nome altisonante si riferisce all’organizzazione unica di specifiche sequenze di DNA all’interno del genoma di diversi microrganismi, che si sono sviluppati naturalmente per assemblare forbici molecolari per contrastare attivamente le infezioni virali [5-6]. Successivamente è stata identificata e denominata “proteina 9 associata a CRISPR” o, più semplicemente, “Cas9” [7-8], una delle proteine ​​del sistema CRISPR più note coinvolte nel taglio delle sequenze virali.

L’immunità mediata dal complesso CRISPR si verifica dopo l’assemblaggio tra la proteina Cas9 e l’RNA CRISPR (crRNA), una breve sequenza di RNA che può accoppiare sequenze complementari del virus invasore o altri acidi nucleici esogeni [9]. Il crRNA agisce come una sorta di scout che conduce finemente Cas9 al DNA estraneo che viene tagliato in una posizione specifica da esso (la forbice molecolare di questo sistema). La posizione in cui avviene il taglio è appena a monte del motivo comunemente chiamato protospacer adiacente (PAM), noto anche come sequenza target che Cas9 usa come riferimento per condurre il taglio con precisione chirurgica [1, 10-11]. Tuttavia, per svolgere il suo ruolo di guida, il crRNA deve maturare attraverso un’interazione stabile, in presenza di Cas9, con un crRNA transattivante (tracrRNA) [12]. Solo comprendendo l’importanza del tracrRNA è stato possibile trovare la chiave per sfruttare il sistema CRISPR.

Nel loro articolo del 2012 Charpentier e Doudna hanno dimostrato che la proteina Cas9 complessata con un solo crRNA era effettivamente incapace di dirigere la scissione della sequenza bersaglio. D’altra parte, aggiungendo un tracrRNA al sistema e consentendo l’accoppiamento tra tali molecole transattivanti e il crRNA maturo, i due scienziati hanno ottenuto un taglio perfetto della sequenza di DNA bersaglio in vitro. Partendo da queste evidenze, la loro ricerca è proseguita con la caratterizzazione fine dei meccanismi molecolari coinvolti nel clivaggio del DNA mediato da Cas9 fino a quando non hanno capito che poteva essere possibile sostituire la coppia tracrRNA: crRNA con un singolo RNA chimerico, preservando la capacità di riconoscimento del target da parte di Cas9.

Per testare l’efficacia del sistema e stabilire se il progetto di questo RNA chimerico potesse essere sufficientemente robusto e universalmente applicabile, Charpentier e Doudna hanno eseguito un semplice ed elegante esperimento in vitro. Hanno progettato cinque diversi RNA chimerici per indirizzare la sequenza di DNA di una proteina fluorescente verde (GFP) e, in tutti e cinque i casi, hanno osservato che la proteina Cas9 guidata da questi RNA chimerici tagliava in modo efficiente e preciso la sequenza GFP. Sembrava una scoperta sorprendente, dal momento che stavano proponendo un nuovo approccio per scindere qualsiasi sequenza di DNA di interesse seguendo una singola proteina Cas9 programmata con RNA guida.

Ma perché tagliare il DNA è così importante e come ha fatto CRISPR/Cas9 diventare la “star” indiscutibile tra le attuali tecnologie di ingegneria genetica?

Gli scienziati hanno modificato i geni per un bel po ‘di tempo prima della rivoluzione CRISPR. Possiamo immaginare il lavoro di un ingegnere genetico come un raffinato processo di taglio e riparazione, dove l’obiettivo finale potrebbe essere, ad esempio, la rimozione di un gene difettoso (mediante taglio) e l’introduzione della controparte funzionante (mediante riparazione). Questo scenario è alla base della terapia genica, dove una nuova sequenza di DNA viene trasportata all’interno del genoma di interesse per sostituirsi o combinarsi con quelli nativi. La cassetta degli attrezzi dell’editing è stata istituita tra il 1994 e il 2010 in uno sforzo congiunto tra il mondo accademico e l’industria, utilizzando tecnologie basate su meganucleasi [13] e nucleasi a dito di zinco (ZFN) [14-15]. Nel 2010-2012, la cassetta degli attrezzi è stata rapidamente arricchita con una terza classe di nucleasi (proteina di taglio del DNA), ingegnerizzando i domini effettrici simili ad attivatori di trascrizione (noti anche come TALEN) [16-17]. Sia ZFN che TALEN sono proteine ​​modulari che interagiscono con il solco principale della struttura a doppia elica del DNA per riconoscere coppie di basi specifiche. Tuttavia, nonostante i vantaggi relativi dell’utilizzo di queste proteine ​​di taglio del DNA precedentemente stabilite, rispetto alla tecnologia emergente Cas9, il sistema basato su ZNF era più impegnativo, richiedeva tempo e particolarmente tossico [18], mentre TALEN sembrava essere difficile da introdurre in cellule, a causa delle sue grandi dimensioni, e meno scalabile per strategie multi-targeting poiché può riconoscere una sequenza alla volta [18-19].

Grazie al lavoro di Charpentier e Doudna, la tecnologia basata su CRISPR / Cas9 è cresciuta esponenzialmente nel corso degli anni, rivelandosi presto economica, rapida ed eccezionalmente versatile come consigliavano. Anticipando ciò che Feng Zhang del Broad Institute ha mostrato sei mesi dopo [20] sulla capacità di CRISPR di lavorare nelle cellule di mammifero, hanno avviato una vera trasformazione scientifica e, allo stesso tempo, sono entrati in una feroce battaglia sui brevetti su chi merita i diritti di proprietà intellettuale per una tale scoperta [21], l’assegnazione del Premio Nobel per il 2020 si è solo leggermente attenuata.