CRISPR NL
CRISPR/Cas9-serie: een meeslepende reis van een primitief bacterieel afweersysteem naar een geavanceerde technologie voor het bewerken van menselijke genen
19/01/2022

CRISPR/Cas9-serie: een meeslepende reis van een primitief bacterieel afweersysteem naar een geavanceerde technologie voor het bewerken van menselijke genen

De bijwerkingen van CRISPR / Cas9 en de huidige strategieën om deze te verminderen

Samenvatting:

  • Het CRISPR/Cas9 systeem knipt vaak niet alleen op de beoogde plaats in het genoom, maar ook op andere ongewenste plaatsen, die off-targets worden genoemd;
  • Off-target incidenten zijn voornamelijk te wijten aan homologie in de sequentie tussen sgRNA en genomisch DNA ergens anders dan het doelwit, evenals aan de mate van zuiverheid en stabiliteit van het sgRNA/Cas9-complex in de cellen;
  • Onderzoekers hebben talloze strategieën geïmplementeerd om off-target effecten tot een minimum te beperken en de veiligheid van het CRISPR/Cas9-systeem te verhogen.

Het CRISPR/Cas9-systeem werkt in bacteriën en archaea als een op RNA gebaseerd, adaptief immuunsysteem. Het is in staat om het Cas9-eiwit naar het complementaire DNA van een binnendringend virus te sturen en het door te knippen en zo te vernietigen. Zoals we in de vorige artikelen hebben geleerd, is CRISPR/Cas9 een van bacteriën afgeleid hulpmiddel voor het bewerken van genen, dat gebruikmaakt van de DNA-reparatiesystemen van cellen, waardoor het mogelijk wordt om gentherapie bij mensen toe te passen. Om de capaciteit om doelgericht genen door te knippen mogelijk te maken, kan het CRISPR-systeem worden nagemaakt met de volgende drie minimale componenten:

  1. het DNA-doorknippende Cas9 eiwit;
  2. een sequentie-specifieke CRISPR RNA (crRNA);
  3. een extra trans-activerend RNA (tracrRNA).

 

De crRNA- en tracrRNA-duplexen kunnen ook worden gefuseerd om een chimerische single-guide-RNA (sgRNA) te genereren [1]. De eerste 20 nucleotiden van het sgRNA zijn complementair aan de doelwit-DNA-sequentie, gevolgd door een sequentie die de Protospacer Adjacent Motif (PAM) wordt genoemd [2]. Door simpelweg de sgRNA-sequentie te veranderen, kunnen de onderzoekers ervoor zorgen dat Cas9 het gen van interesse bereikt en precies in de doelwit-DNA-sequentie naast de PAM knipt [3].

De bijwerkingen van CRISPR / Cas9 en de huidige strategieën om deze te verminderen_1

Ondanks dat het CRISPR/Cas9-systeem een ongeëvenaarde technologie voor het bewerken van het genoom blijkt te zijn, zijn er nog steeds verschillende zorgen over de grootschalige therapeutische en klinische toepassingen ervan.

CRISPR/Cas9 is een extreem krachtig systeem, maar ook erg onnauwkeurig [4]. De sgRNA zorgt ervoor dat Cas9 op andere plaatsen knipt dan in de beoogde doelwit-locatie, en veroorzaakt vervolgens de zogenaamde “off-target” -mutaties met een zeer hoge frequentie (>50%) [5-6]. Een off-target incident is een bijwerking van Cas9-gemedieerde genoombewerking, wat resulteert in DNA-veranderingen die kunnen leiden tot onvoorspelbare nadelige biologische uitkomsten. Deze off-target breuken zijn het gevolg van kleine verschillen (of mismatches) tussen de sgRNA en de doelwit-DNA-sequentie. Het Cas9-eiwit merkt ze niet op en knipt de verkeerde code door alsof dit het daadwerkelijke doelwit is.

De 20 nucleotiden van sgRNA zijn door onderzoekers zo ontworpen om complementair te zijn aan de DNA-sequentie van het gen van belang. Dit betekent dat sgRNA en doelwit-DNA-sequenties perfect bij elkaar passen. Desalniettemin kunnen andere DNA-sequenties in de gastheercel gedeeltelijk vergelijkbaar zijn met het motief waarop sgRNA/Cas9 zich richt. Naast de identieke sequenties zoals het doelwit, worden ook gelijkaardige sequenties door Cas9 herkend en doorgeknipt, en het aantal off-target locaties hangt sterk af van hoeveel van deze homologe sequenties in het genoom voorkomen.

Off-target effecten kunnen celtype-specifiek zijn en in hoge mate afhankelijk van de integriteit van de DNA-reparatieroutes van een bepaald celtype [7]. Bovendien is gevonden dat de mate van zuiverheid van Cas9-eiwit en sgRNA de specificiteit van doorknippen beïnvloedt. Er is gemeld dat de tijd die Cas9 in de cellen doorbrengt recht evenredig is met de toename van off-target-incidenten [8]. Het zou dus voordelig zijn als het sgRNA/Cas9-complex het doelwit-DNA vrijwel onmiddellijk na aankomst doorknipt en snel wordt afgebroken in cellen.

Om de CRISPR/Cas9-technologie in het zorgsysteem te kunnen brengen, is de noodzaak om off-target incidenten effectief te verminderen een prioriteit geworden. In feite vormen off-target effecten bij het bewerken van genen een niet te verwaarlozen risico voor de veiligheid van patiënten, omdat ze DNA-veranderingen kunnen veroorzaken die zich kunnen ontwikkelen in kanker of andere ongewenste resultaten. In het licht van deze overwegingen zijn er verschillende benaderingen voorgesteld om off-target effecten tot een minimum te beperken.

De bijwerkingen van CRISPR / Cas9 en de huidige strategieën om deze te verminderen_2

Een eerste aanpak is gebaseerd op het wijzigen van de sgRNA-sequentie. De inkorting van sgRNA of de toevoeging van twee specifieke nucleotiden, guanines genaamd, aan het einde van sgRNA, verbetert de doelwitspecificiteit vooral. Hierdoor kunnen ongewenste mutaties op sommige off-target locaties onder de 1% afnemen. Modificaties van de sgRNA-sequentie om de Cas9-specificiteit te verbeteren zonder de efficiëntie op het doelwit in gevaar te brengen, hebben echter geen betrouwbare resultaten opgeleverd [9]. Een tweede veelbelovende strategie voor het minimaliseren van off-target effecten is het controleren van de concentratie en formulering van het sgRNA/Cas9-complex, om de stabiliteit en gedrag in de cellen nauwkeurig te regelen [10]. Andere benaderingen zijn gericht op de aanpassing van Cas9 zelf. Om de specificiteit van DNA-splijting verder te verbeteren, zijn fusies van inactief Cas9 met het FokI-nucleasedomein gegenereerd. Gemodificeerd Cas9 is in staat om doelwit-DNA te bewerken met een aanzienlijk hogere specificiteit dan zijn wildtype tegenhanger, wat het aantal off-target incidenten enorm vermindert [11].

De afgelopen jaren zijn er veel andere verbeterde technieken opgekomen om het CRISPR/Cas9-systeem geschikt te maken voor klinische toepassingen. Vooruitgang op het gebied van bio-informatica en genetische technieken biedt hulpmiddelen om sgRNA en Cas9 te verbeteren aangaande werkzaamheid en veiligheid [12].

Terwijl onderzoekers zich haasten om off-target effecten te verminderen, worden clinici gedwongen te kiezen tussen het toedienen van de gentherapie en daarmee het risico lopen op off-target mutaties of het opgeven van deze therapie en de kans missen om de patiënt te behandelen. Momenteel zijn er meer dan 20 klinische onderzoeken goedgekeurd voor het gebruik van de CRISPR/Cas9-technologie bij patiënten [13]. De implicaties van de kosten-batenverhouding in het toenemende gebruik van CRISPR/Cas9 leiden vervolgens tot de vraag naar stricte regelgevende instanties en medisch-ethische besturen. Dit om misbruik of morele afdwalingen te voorkomen, zoals in het geval van de (beruchte) Chinese CRISPR-baby’s. Dit zal het volgende onderwerp van deze reeks worden.

References:

  1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  2. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
  3. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009. 
  4. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
  5. Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
  6. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
  7. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
  8. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024. 
  9. Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
  10. Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
  11. Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
  12. Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
  13. Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.
Raniero Chimienti
0
Tags :