Tegoroczna nagroda Nobla z Chemii zwróciła uwagę świata w kierunku dwójki naukowców, którzy rozpoczęli rewolucję w naukach przyrodniczych i celowanej terapii genowej. Badaczki przekształciły mechanizm odpornościowy bakterii – CRISPR – w molekularne narzędzie zdolne do łatwej, taniej i dokładnej edycji genomu szerokiej gamy komórek eukariotycznych, w tym ludzkich. 

W celu uhonorowania naukowców, którzy przyczynili się do rozwoju w tej technologii, dedykujemy mini-serię artykułów tematyce CRISPR-Cas.

Jak doniosły wydawnictwa z całego świata, nagroda Nobla została przyznana wspólnie Prof. Dr Emmanuelle Charpentier z wydziału Nauki o Patogenach (Max Planck) oraz Prof. Dr Jennifer Doudna z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Berkeley za “opracowanie metody edycji genomu”. Badaczki opisały swoje odkrycia w czerwcowym wydaniu dziennika Science w 2012 roku [1]. Zanim omówimy temat ich pracy, opiszemy czym jest CRISPR i jakie były etapy poprzedzające to wielopomne odkrycie.

Minęły dwie dekady od kiedy molekularny system obronny wyewoluowany przez mikroby został odkryty przez mikrobiologa Francisa Mojica z Uniwersytetu Alicante w Hiszpanii [2-3]. Nazwał ten system CRISPR, co oznaczało zgrupowane, regularnie rozproszone, krótkie, powtarzające się sekwencje palindromiczne (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) [4]. Ta skomplikowana nazwa odnosi się do wyjątkowej organizacji konkretnych sekwencji DNA wewnątrz genomu niektórych mikroorganizmów. Sekwencje te tworzą ‘nożyce’ molekularne zdolne do aktywnego zwalczania infekcji wirusowych [5-6]. Jedno z bardziej znanych białek tnących sekwencje wirusowe zostało zidentyfikowane i nazwane, w uproszczonej formie, “Cas9” [7-8].

Odporność związana z kompleksami opartymi na CRISPR występuje po połączeniu białka Cas9 z RNA CRISPR (crRNA), krótką sekwencją RNA, która wiąże przystające do siebie sekwencje atakującego wirusa lub innych zewnętrznych kwasów nukleinowych [9]. crRNA działa jako rodzaj zwiadowcy, który prowadzi Cas9 do obcego DNA. Jest ono wówczas dzielone w konkretnym miejscu przez ww. ‘nożyce’ molekularne. Miejsce dzielenia, czy też cięcia, jest ponad sekwencją PAM, znaną również jako sekwencja identyfikująca, której Cas9 używa jako wskaźnika do precyzyjnego cięcia [1, 10-11]. Aby crRNA mogło wypełnić rolę przewodnika, musi ono wejść w interakcję z tracrRNA (trans-aktywującą cząsteczką pomagającą namierzyć pożądane sekwencje) w obecności Cas9 [12]. Zrozumienie roli tracrRNA było kluczowe dla opracowania systemu CRISPR.

W publikacji z 2012 Charpentier i Doudna wykazały, że białko Cas9 związane z samym crRNA nie jest w stanie poprowadzić cięcia docelowej sekwencji. Z drugiej strony, dodanie tracrRNA do systemu i jego interakcja z crRNA pozwoliło na skuteczne cięcie danej sekwencji DNA in vitro. Bazując na tym dowodzie, badaczki opisały molekularne mechanizmy związane z cięciami wspomaganymi Cas9. Później odkryto, że kombinację tracrRNA:crRNA można zastąpić pojedynczym chimerycznym RNA, zachowując zdolność Cas9 do rozpoznania celu.

Charpentier i Doudna wykonały prosty eksperyment in vitro mający na celu sprawdzenie wydajności systemu i uniwersalnej aplikacji chimerycznego RNA. Opracowano pięć różnych typów chimerycznego RNA rozpoznającego docelowe DNA białka zielonej fluorescencji (GFP) i, we wszystkich przypadkach, Cas9 poprowadzone przez chimeryczne RNA precyzyjnie i skutecznie wycięło dane sekwencje. Było to niesłychane osiągnięcie, ponieważ wskazywało na nowe podejście do cięcia sekwencji DNA z pomocą pojedynczych białek Cas9 zaprogramowanych przez RNA.

Czemu zatem cięcie DNA jest ważne i jak CRISPR/Cas9 stał się najbardziej obiecującą metodą w technologiach inżynierii genetycznej?

Naukowcy edytowali geny na długo przed rewolucją CRISPR. Taką pracę można opisać jako precyzyjne cięcie i łączenie, gdzie celem jest, na przykład, usunięcie wadliwego genu i wprowadzenie poprawnego odpowiednika. Taki scenariusz jest bazą dla terapii genowej, gdzie sekwencja DNA jest przenoszona wewnątrz danego genomu celem zamiany lub połączania z natywnym genem. Zestaw narzędziowy dla tego typu edycji został opracowany między 1994 a 2010 w kolaboracji pomiędzy światem nauki i światem przemysłu. Użyto w tym celu technologii opartej na meganuklezach [13] oraz nukleazach z motywem palca cynkowego (ZFN) [14-15]. W latach 2010-2012, narzędzia wzbogacono o trzecią klasę nukleaz (białka tnące DNA). Otrzymano ją w wyniku manipulacji domen nukleaz TALE (TALEN). Zarówno ZFN jak i TALEN są modułowymi białkami, które wchodzą w interakcje z głównym rowkiem DNA i podwójną helisą, aby rozpoznać konkretne pary zasadowe. Jednakże, mimo swoich zalet, wcześniejsze technologie oparte na ZFN były bardziej czasochłonne, skomplikowane i toksyczne [18] w porównaniu do technologii CRISPR. Te oparte na TALEN, były natomiast trudniejsze w aplikacji ze względu na większy rozmiar białek, mniejszą skalowalność i brak możliwości użycia do kilku sekwencji na raz [18-19].

Dzięki odkryciu Charpentier and Doudna, technologia CRISPR/Cas9 rozwinęła się gwałtownie przez lata, by szybko okazać się tanią, łatwą i uniwersalną metodą edycji genów. Wyprzedzając późniejszą pracę Feng Zhanga z Broad Institute (połączone instytuty Harvard i Massachusetts Institute of Technology) dotyczącą aplikacji CRISPR w komórkach ssaków, Charpienter i Doudna rozpoczęły prawdziwę naukową transformację i, tym samym, zaangażowały się w walkę o patent i prawa do pracy intelektualnej [21], którą delikatnie załagodziło przyznanie nagrody Nobla.