CRISPR PL
Seria CRISPR/Cas9: fascynująca podróż od prymitywnego systemu obronnego bakterii do zaawansowanej technologii edycji ludzkich genów
19/01/2022

Seria CRISPR/Cas9: fascynująca podróż od prymitywnego systemu obronnego bakterii do zaawansowanej technologii edycji ludzkich genów

Efekty uboczne metody CRISPR / Cas9 i aktualne sposoby ich zapobiegnia

Podsumowanie:

  • System CRISPR/Cas9 często tnie genom nie tylko w zamierzonym miejscu, ale również w innych niepożądanych miejscach, które nazywane są off-targetami;
  • Zdarzenia off-target wynikają głównie z braku homologii sekwencji (sekwencja homologiczna) pomiędzy sgRNA a docelowym genomowym DNA oraz ze stopnia czystości i stabilności kompleksu sgRNA/Cas9 wewnątrz komórek;
  • Naukowcy wdrożyli liczne strategie mające na celu zminimalizowanie efektów off-targetowych i zwiększenie bezpieczeństwa systemu CRISPR/Cas9.

System CRISPR/Cas9 wywodzi się z bakterii i archeonów (archeony). Jest to adaptacyjny system immunologiczny oparty na RNA. Białko Cas9 jest w nim kierowane do komplementarnego DNA (komplementarne DNA) atakującego wirusa aby je przeciąć i w ten sposób zniszczyć. Jak dowiedzieliśmy się w poprzednich artykułach (CRISPR1, CRISPR2), CRISPR/Cas9 jest pochodzącym z bakterii narzędziem do edycji genów. Wykorzystuje ono systemy naprawy DNA komórek, co daje szansę na terapię genową u ludzi. Aby umożliwić ukierunkowanie genów, system CRISPR może być replikowany przy użyciu następujących trzech niezbędnych komponentów:

  1. białka tnącego DNA Cas9;
  2. specyficznego sekwencyjnie CRISPR RNA (crRNA);
  3. pomocniczy trans-aktywujący RNA (tracrRNA).

Dupleksy crRNA i tracrRNA mogą być również łączone w celu wytworzenia chimerycznego jednoniciowego RNA (sgRNA) [1]. Pierwsze 20 nukleotydów (nukleotyd) sgRNA jest komplementarne do docelowej sekwencji DNA (komplementarne DNA), po czym następuje sekwencja zwana motywem PAM (Protospacer Adjacent Motif) [2]. Po prostu zmieniając sekwencję sgRNA, badacze mogą sprawić, że Cas9 dotrze do interesującego nas genu i przetnie dokładnie docelową sekwencję DNA sąsiadującą z PAM [3].

Efekty uboczne metody CRISPR / Cas9 i aktualne sposoby ich zapobiegnia_1

Mimo że system CRISPR/Cas9 okazał się być niezrównany w edycji genomu, nadal istnieje kilka wątpliwości odnośnie do użycia go na szeroką skalę w terapeutyce i badaniach klinicznych.

CRISPR/Cas9 jest systemem niezwykle potężnym, ale również bardzo niedokładnym [4]. SgRNA powoduje cięcie przez Cas9 w innych miejscach niż zamierzone, powodując tzw. mutacje „off-target” z bardzo wysoką częstością (>50%) [5-6]. Zdarzenie off-target jest efektem ubocznym edycji genomu przez białko Cas9, skutkującym zmianami DNA, które mogą prowadzić do nieprzewidywalnych i niekorzystnych biologicznie skutków. Cięcia poza celem są konsekwencją niewielkich różnic (lub niedopasowań) pomiędzy sgRNA a docelową sekwencją DNA. Białko Cas9 nie zauważa tych różnic, tnąc niewłaściwą sekwencję, tak jakby była ona tą, na którą jest ukierunkowane.

Kiedy badacze projektują 20 komplemetarnych nukleotydów (nukleotyd) sgRNA do sekwencji DNA interesującego nas genu (komplementarne DNA), pasują one do siebie idealnie. Niemniej jednak, inne sekwencje DNA w komórce gospodarza mogą być częściowo podobne do motywu namierzanego przez sgRNA/Cas9. Podobne, ale nie identyczne sekwencje do interesującej nas sekwencji są również rozpoznawane i cięte przez Cas9, a liczba miejsc off-target silnie zależy od tego, jak wiele takich homologicznych sekwencji (sekwencja homologiczna) istnieje w genomie.

Efekty off-target mogą być specyficzne dla danego typu komórki i w dużym stopniu zależne od integralności szlaków naprawy DNA (szlak naprawy DNA) danego typu komórki [7]. Ponadto stwierdzono, że stopień czystości białka Cas9 i sgRNA wpływa na specyficzność aktywności rozszczepiania. Stwierdzono, że czas, jaki Cas9 spędza wewnątrz komórek jest wprost proporcjonalny do wzrostu liczby zdarzeń off-target [8], dlatego korzystne byłoby, aby kompleks sgRNA/Cas9 rozszczepiał docelowe DNA niemal natychmiast po dostarczeniu i był szybko degradowany w komórkach.

Aby móc wprowadzić technologię CRISPR/Cas9 do systemu opieki zdrowotnej, priorytetem stała się skuteczna redukcja zdarzeń off-target. Efekty niezamierzone w edycji genów stanowią niebagatelne ryzyko dla bezpieczeństwa pacjentów, ponieważ mogą powodować zmiany w DNA. Te mogą prowadzić do rozwoju nowotworów lub innych niepożądanych skutków. W świetle tych rozważań, zaproponowano kilka metod mających na celu zminimalizowanie efektów off-target.

Efekty uboczne metody CRISPR / Cas9 i aktualne sposoby ich zapobiegnia_2

Pierwszy sposób opiera się na zmianie sekwencji sgRNA. Obcięcie sgRNA lub dodanie dwóch specyficznych nukleotydów (nukleotyd) zwanych guaninami (guanina) na końcu sgRNA poprawia specyficzność docelową. Zmniejsza to niepożądane mutacje w niektórych niezamierzonych miejscach poniżej 1%. Jednakże modyfikacje sekwencji sgRNA zwiększające specyficzność Cas9 bez pogorszenia wydajności docelowej nie przyniosły wiarygodnych rezultatów [9]. Drugą obiecującą strategią minimalizowania efektów off-target jest kontrola stężenia i składu kompleksu sgRNA/Cas9, w celu precyzyjnego sterowania jego stabilnością i zachowaniem wewnątrz komórek [10]. Inne podejścia koncentrują się na modyfikacji samego Cas9. W szczególności, w celu dalszej poprawy specyficzności cięcia DNA, wygenerowano fuzje nieaktywnego Cas9 z domeną nukleazy FokI (domena nukleazy FokI). Zmodyfikowany Cas9 jest w stanie edytować docelowe DNA ze znacznie wyższą specyficznością niż typ dziki, a także w ogromnym stopniu zredukować liczbę zdarzeń off-target [11].

W ostatnich latach pojawiło się wiele innych narzędzi nowej generacji, dzięki którym system CRISPR/Cas9 może być wykorzystywany w zastosowaniach klinicznych. Postępy w bioinformatyce i inżynierii genetycznej dostarczają narzędzi do ulepszania sgRNA i Cas9 pod względem skuteczności i bezpieczeństwa [12].

Podczas gdy naukowcy prześcigają się w łagodzeniu efektów off-target, lekarze mogą być zmuszeni do wyboru pomiędzy podaniem terapii genowej i ryzykowaniem wystąpienia mutacji nieporządanych lub rezygnacją z terapii i utratą szansy na wyleczenie pacjenta. Obecnie zatwierdzonych jest ponad 20 badań klinicznych stosujących technologię CRISPR/Cas9 u pacjentów [13]. Stosunek kosztów do korzyści wynikające z coraz szerszego stosowania CRISPR/Cas9 wymaga stworzenia silnych instytucji regulacyjnych i komisji etyki medycznej, które zapobiegałyby nadużyciom i naruszeniom moralnym, jak w przypadku (nie)sławnych chińskich dzieci z CRISPR, które będą kolejnym tematem tej serii.

Źródła:

  1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  2. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
  3. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009. 
  4. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
  5. Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
  6. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
  7. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
  8. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024. 
  9. Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
  10. Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
  11. Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
  12. Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
  13. Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.
Raniero Chimienti
0
Tags :