Série CRISPR/Cas9: uma viagem fascinante do sistema primitivo de defesa bacteriana até uma tecnologia avançada de edição de genes humanos
Os efeitos secundários do CRISPR / Cas9 e as estratégias atuais para os mitigar
Resumo:
- O sistema CRISPR/Cas9 frequentemente não corta apenas no local pretendido do genoma, mas também em outros locais indesejados, que são chamados de eventos “fora-do-alvo”;
- Os eventos fora-do-alvo são maioritariamente devidos à homologia de sequência entre o sgRNA e o ADN genómico que não inclui o alvo, bem como ao grau de pureza e estabilidade do complexo sgRNA/Cas9 no interior das células;
- Investigadores implementaram numerosas estratégias para minimizar os efeitos fora do alvo e aumentar a segurança do sistema CRISPR/Cas9.
O sistema CRISPR/Cas9 funciona em bactérias e archaea como um sistema imunitário adaptativo baseado em ARN. É capaz de direcionar a proteína Cas9 para o ADN complementar de um vírus invasor, e assim cortá-lo e destruí-lo. Como aprendemos nos artigos anteriores (CRISPR1, CRISPR2), o CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição de genes derivada de bactérias que toma partido de sistemas de reparação de ADN de células, proporcionando uma oportunidade de fazer terapia genética em humanos. Para usar a sua capacidade de selecção de genes, o sistema CRISPR pode ser replicado utilizando os três componentes mínimos seguintes:
1) a proteína Cas9, que corta o ADN;
2) um CRISPR ARN (crRNA) específico da sequência;
3) um ARN trans-activador auxiliar (tracrRNA).
As duplas do crRNA e tracrRNA também podem ser fundidas para gerar um ARN guia-único quimérico (sgRNA) [1]. Os primeiros 20 nucleótidos do sgRNA são complementares à sequência de ADN alvo, seguidos por uma sequência PAM (Protoscpacer Adjacent Motif em Inglês) [2]. Simplesmente alterando a sequência sgRNA, os investigadores podem fazer com que o Cas9 alcance o gene de interesse e corte exatamente na sequência de ADN alvo adjacente à PAM [3].
Apesar do sistema CRISPR/Cas9 ter demonstrado ser uma tecnologia de edição de genoma sem paralelo, existem ainda várias preocupações quanto às suas aplicações terapêuticas e clínicas em larga escala.
O CRISPR/Cas9 é um sistema extremamente poderoso, mas também muito impreciso [4]. O sgRNA induz o Cas9 a cortar noutros locais que não o pretendido no alvo, causando depois as chamadas mutações “fora-do-alvo” com frequência muito elevada (>50%) [5-6]. Um evento fora-do-alvo é um efeito secundário da edição de genoma mediada pelo Cas9, resultando em alterações do ADN que podem conduzir a resultados biológicos adversos imprevisíveis. Esta atividade de clivagem fora do alvo é a consequência de pequenas diferenças (ou desencontros) entre o sgRNA e a sequência de ADN alvo. A proteína Cas9 não as detecta, cortando assim a sequência errada como se fosse a realmente pretendida.
Quando os 20 nucleótidos de sgRNA são concebidos pelos investigadores para serem complementares à sequência de ADN do gene de interesse, significa que o sgRNA e as sequências de ADN alvo correspondem perfeitamente a um com o outro. No entanto, outras sequências de ADN na célula hospedeira podem ser parcialmente semelhantes ao motivo alvo do sgRNA/Cas9. Sequências semelhantes mas não idênticas à de interesse são também reconhecidas e clivadas pelo Cas9, e o número de locais fora do alvo depende fortemente de quantas destas sequências homólogas existem dentro do genoma.
Os efeitos fora do alvo podem ser específicos do tipo de célula e altamente dependentes da integridade das vias de reparação do ADN de um determinado tipo de célula [7]. Além disso, verificou-se que o grau de pureza da proteína Cas9 e do sgRNA afecta a especificidade da atividade de clivagem. Foi relatado que o tempo que a Cas9 passa dentro das células é diretamente proporcional ao aumento de eventos fora do alvo [8], pelo que seria vantajoso que o complexo sgRNA/Cas9 clivasse o ADN alvo quase imediatamente após o parto e fosse degradado rapidamente nas células.
Para se poder trazer a tecnologia CRISPR/Cas9 para o sistema de saúde, a necessidade de reduzir eficazmente os eventos fora do alvo tornou-se uma prioridade. Na verdade, os efeitos fora do alvo na edição genética representam um risco não negligenciável para a segurança dos doentes, uma vez que podem causar alterações de ADN que podem evoluir no cancro ou outros resultados indesejados. À luz destas considerações, foram propostas várias abordagens para minimizar os efeitos fora do alvo.
Uma primeira abordagem baseia-se na alteração da sequência de sgRNA. Especificamente, a truncagem do sgRNA ou a adição de dois nucleótidos específicos chamados guaninas no final do sgRNA melhora a especificidade do alvo e diminui as mutações indesejadas em alguns locais fora-do-alvo abaixo de 1%. Contudo, as modificações da sequência de sgRNA para melhorar a especificidade de Cas9 sem comprometer a eficiência do alvo, não forneceram resultados fiáveis [9]. Uma segunda estratégia promissora para minimizar os efeitos fora do alvo é controlar a concentração e formulação do complexo sgRNA/Cas9, a fim de controlar finamente a sua estabilidade e comportamento dentro das células [10]. Outras abordagens centram-se na modificação do próprio Cas9. Em particular, para melhorar ainda mais a especificidade da clivagem do ADN, foram geradas fusões de Cas9 inactivo com o domínio de nuclease FokI. O Cas9 modificado é capaz de editar o ADN alvo com uma especificidade significativamente mais elevada do que o seu homólogo selvagem, e reduz drasticamente os eventos fora do alvo [11].
Muitas outras ferramentas “nova geração” têm vindo a surgir nos últimos anos para tornar o sistema CRISPR/Cas9 adequado para aplicações clínicas. Os avanços na bioinformática e engenharia genética estão a fornecer ferramentas para melhorar o sgRNA e Cas9 em termos de eficácia e segurança [12].
Enquanto os investigadores se apressam para mitigar os efeitos fora do alvo, os clínicos podem ser forçados a escolher entre administrar a terapia genética e incorrer no risco de mutações fora do alvo ou desistir desta terapia e perder a oportunidade de tratar o paciente. Atualmente, mais de 20 ensaios clínicos foram aprovados para a utilização da tecnologia CRISPR/Cas9 em doentes [13]. As implicações da relação custo/benefício do uso crescente do CRISPR/Cas9 estão então a levar à procura de instituições reguladoras e conselhos de ética médica fortes para prevenir qualquer abuso ou transgressões morais, como no caso dos famosos (ou infames) bebés CRISPR chineses, que serão o próximo tópico desta série.
Referências:
- Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
- Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
- Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009.
- Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
- Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
- Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
- Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
- Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024.
- Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
- Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
- Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
- Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
- Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.