CRISPR RU
Серия CRISPR/Cas9: захватывающий путь от примитивной системы защиты бактерий к передовой технологии редактирования генома человека
19/01/2022

Серия CRISPR/Cas9: захватывающий путь от примитивной системы защиты бактерий к передовой технологии редактирования генома человека

Побочные эффекты CRISPR/Cas9 и текущие стратегии по их устранению

Краткое содержание:

  • Система CRISPR/Cas9 часто разрезает не только предполагаемый участок генома, но и другие нежелательные места, которые называются нецелевыми;
  • Нецелевые события в основном обусловлены гомологией между sgRNA и последовательностями геномной ДНК, отличными от целевой, а также степенью чистоты и стабильности комплекса sgRNA/Cas9 внутри клеток;
  • Исследователи внедрили многочисленные стратегии для минимизации нецелевых эффектов и повышения безопасности системы CRISPR/Cas9.

Система CRISPR/Cas9 функционирует в бактериях и археях как адаптивная иммунная система на основе РНК, которая способна направить белок Cas9 на комплементарную ДНК вторгающегося вируса и таким образом разрезать и уничтожить его. Как мы узнали из предыдущих статей, CRISPR/Cas9 — это инструмент редактирования генов бактериального происхождения, который использует системы репарации ДНК клеток, предоставляя возможность проводить генную терапию у людей. Для того чтобы система CRISPR могла воздействовать на гены, она может быть воспроизведена с помощью следующих трех минимальных компонентов:

  1. ДНК-режущий белок Cas9;
  2. специфическая для последовательности CRISPR РНК (crRNA);
  3. вспомогательная транс-активирующая РНК (трасРНК).

Дуплексы crRNA и tracrRNA также могут быть объединены для создания химерной однонаправленной РНК (sgRNA) [1]. Первые 20 нуклеотидов sgRNA комплементарны последовательности ДНК-мишени, за ними следует последовательность, называемая мотивом примыкания протоспейсера (PAM) [2]. Просто изменив последовательность сгРНК, исследователи могут заставить Cas9 достичь интересующего их гена и точно разрезать целевую последовательность ДНК, прилегающую к PAM [3].

article_45_tech_halved_1_RUS_small

Несмотря на то, что система CRISPR/Cas9 продемонстрировала себя как непревзойденная технология редактирования генома, до сих пор существует ряд проблем, препятствующих ее широкомасштабному терапевтическому и клиническому применению.

CRISPR/Cas9 — чрезвычайно мощная система, но и очень неточная [4]. СгРНК побуждает Cas9 делать разрезы в других местах, отличных от целевых, вызывая так называемые «внецелевые» мутации с очень высокой частотой (>50%) [5-6]. Внецелевое событие является побочным эффектом Cas9-опосредованного редактирования генома, приводящим к изменениям ДНК, которые могут привести к непредсказуемым неблагоприятным биологическим последствиям. Активность расщепления вне мишени является следствием небольших различий (или несоответствий) между сгРНК и целевой последовательностью ДНК, которые белок Cas9 не замечает, разрезая неправильную последовательность, как если бы она была целевой.

Когда 20 нуклеотидов сгРНК сконструированы исследователями так, чтобы быть комплементарными к последовательности ДНК интересующего гена, это означает, что последовательности сгРНК и целевой ДНК идеально совпадают одна с другой. Тем не менее, другие последовательности ДНК в клетке-хозяине могут быть частично похожи на мотив, на который нацелена сгРНК/Cas9. Последовательности, сходные, но не идентичные интересующей последовательности, также распознаются и расщепляются Cas9, и количество внецелевых сайтов сильно зависит от того, сколько таких гомологичных последовательностей существует в геноме.

Внецелевые эффекты могут быть клеточно-специфичными и сильно зависеть от целостности путей репарации ДНК в конкретном типе клеток [7]. Кроме того, было установлено, что степень чистоты белка Cas9 и сгРНК влияет на специфичность расщепляющей активности. Сообщалось, что время, которое Cas9 проводит внутри клеток, прямо пропорционально увеличению количества событий вне клетки [8], поэтому было бы выгодно, чтобы комплекс sgRNA/Cas9 расщеплял целевую ДНК почти сразу после доставки и быстро разрушался в клетках.

Для того чтобы технология CRISPR/Cas9 могла быть внедрена в систему здравоохранения, необходимость эффективного снижения внецелевых событий стала приоритетной. На самом деле, внецелевые эффекты при редактировании генов представляют собой немалый риск для безопасности пациентов, поскольку они могут вызвать изменения ДНК, которые могут привести к развитию онкологии или другим нежелательным последствиям. В свете этих соображений было предложено несколько подходов для минимизации внецелевых эффектов.

article_45_tech_halved_2_RUS_small

В первую очередь, путем изменения последовательности сгРНК: усечение сгРНК или добавление двух специфических нуклеотидов, называемых гуанинами, в конце сгРНК улучшает специфичность мишени, снижая нежелательные мутации в некоторых внецелевых сайтах до 1%. Однако модификации последовательности сгРНК для повышения специфичности Cas9 без ущерба для эффективности на мишени не дали надежных результатов [9].

Вторая перспективная стратегия минимизации внецелевых эффектов заключается в контроле концентрации и состава комплекса sgRNA/Cas9, чтобы точно контролировать его стабильность и поведение внутри клеток [10]. Другие подходы направлены на модификацию самого Cas9. В частности, для дальнейшего улучшения специфичности расщепления ДНК были созданы слияния неактивного Cas9 с нуклеазным доменом FokI. Модифицированный Cas9 способен редактировать целевую ДНК со значительно более высокой специфичностью, чем его аналог дикого типа, и значительно сократить количество событий вне мишени [11].

В последние годы появилось множество других инструментов нового поколения, позволяющих сделать систему CRISPR/Cas9 пригодной для клинического применения. Достижения в области биоинформатики и генной инженерии предоставляют инструменты для улучшения sgRNA и Cas9 с точки зрения эффективности и безопасности [12].

В то время как исследователи пытаются нивелировать внецелевые эффекты, клиницисты могут быть вынуждены выбирать между назначением генной терапии и риском внецелевых мутаций или отказом от такой терапии и упущенной возможностью вылечить пациента. В настоящее время одобрено более 20 клинических исследований для использования технологии CRISPR/Cas9 у пациентов [13]. Соотношение затрат и выгод от все более широкого использования CRISPR/Cas9 приводит к необходимости создания сильных регулирующих институтов и советов по медицинской этике, чтобы предотвратить любые злоупотребления или моральные нарушения, как в случае с (не)известными китайскими CRISPR-младенцами, о которых мы расскажем в следующей теме этой серии.

Библиография:

  1. Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829.
  2. Anders C, Niewoehner O, Duerst A, Jinek M. Structural basis of PAM-dependent target DNA recognition by the Cas9 endonuclease. Nature. 2014;513(7519):569-73. doi: 10.1038/nature13579.
  3. Ceasar SA, Rajan V, Prykhozhij SV, Berman JN, Ignacimuthu S. Insert, remove or replace: A highly advanced genome editing system using CRISPR/Cas9. Biochim Biophys Acta. 2016;1863(9):2333-44. doi: 10.1016/j.bbamcr.2016.06.009. 
  4. Lin Y, Cradick TJ, Brown MT, et al. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences. Nucleic Acids Res. 2014;42(11):7473-7485. doi:10.1093/nar/gku402
  5. Zhang XH, Tee LY, Wang XG, Huang QS, Yang SH. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Mol Ther Nucleic Acids. 2015 Nov 17;4(11):e264. doi: 10.1038/mtna.2015.37. PMID: 26575098; PMCID: PMC4877446.
  6. Fu Y, Foden JA, Khayter C, Maeder ML, Reyon D, Joung JK, Sander JD. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2013;31(9):822-6. doi: 10.1038/nbt.2623.
  7. Lin S, Staahl BT, Alla RK, Doudna JA. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. Elife. 2014;3:e04766. doi:10.7554/eLife.04766.
  8. Liang X, Potter J, Kumar S, Zou Y, Quintanilla R, Sridharan M, Carte J, Chen W, Roark N, Ranganathan S, Ravinder N, Chesnut JD. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. J Biotechnol. 2015;208:44-53. doi: 10.1016/j.jbiotec.2015.04.024. 
  9. Han HA, Pang JKS, Soh BS. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. J Mol Med (Berl). 2020;98(5):615-632. doi:10.1007/s00109-020-01893-z.
  10. Alkan F, Wenzel A, Anthon C, Havgaard JH, Gorodkin J. CRISPR-Cas9 off-targeting assessment with nucleic acid duplex energy parameters. Genome Biol. 2018;19(1):177. doi: 10.1186/s13059-018-1534-x.
  11. Saifaldeen M, Al-Ansari DE, Ramotar D, Aouida M. CRISPR FokI Dead Cas9 System: Principles and Applications in Genome Engineering. Cells. 2020;9(11):2518. doi: 10.3390/cells9112518.
  12. Naeem M, Majeed S, Hoque MZ, Ahmad I. Latest Developed Strategies to Minimize the Off-Target Effects in CRISPR-Cas-Mediated Genome Editing. Cells. 2020;9(7):1608. Published 2020 Jul 2. doi:10.3390/cells9071608.
  13. Uddin F, Rudin CM, Sen T. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future. Front Oncol. 2020;10:1387. doi: 10.3389/fonc.2020.01387.
Raniero Chimienti
0
Tags :